2020-08-24质粒构建

2020-08-24质粒构建

获取一个基因CDS序列的方法如下

打开NCBI（ https://.ncbi.nlm.nih.gov ），如下图，按照顺序，在1处选择Nucleotide，在2处输入“PDCD1”，点击3处的Search，等出来结果之后点击4处的“Homo Sapiens”进行进一步筛选（如果你要做鼠源的就选Mus musculus，其他种属选择相应的名称即可进一步筛选了）

然后第一条就是我们需要的序列信息，点击进去，往下拉，直到看到CDS（如下图）

点击CDS，就出现了下图中所示内容，其中加了底色的部分序列便是我们需要的序列了，可以看到这段序列开头是ATG起始密码子，三位是TGA终止密码子。选中这段序列复制即可。

由于需要PCR整个CDS区域，所以正反向引物并没有多少选择的余地，甚至可以参照上述原则简单粗暴的从正反向各选择22个碱基左右作为引物，例如!

正向引物序列与CDS相同，反向引物序列与CDS互补。要注意的是写引物等序列都是要5’到3’的方向，一般不会从3’到5’，所以我们的CDS虽然没有注明方向，其实也是5’到3’。

虽然可以这么简单粗暴的设计引物，还是想借此教大家使用一下引物设计的经典软件Primer Premier 5。

Primer 5的使用

如下图，点击File->New->DNA Sequence，

然后点击空白处Ctrl+V粘贴我们的CDS序列，选择As is，即我们复制的是什么样的序列就粘贴的什么样的序列。

下面的依次是“反向序列粘贴”、“互补序列粘贴”“反向互补序列粘贴”。

点击左上角的Primer，如下图，S=Sense，A=Antisense

如果对现在的引物不满意，还可以点击Edit Primers编辑序列，如下图，我们删除掉末尾三个碱基，之后需要先点击Analyse，然后才能点击OK，我们可以看到正向引物已经从25个碱基变为22个碱基了。

点击Edit->Copy->Sense Primer，粘贴到Word中即可得到正向引物，反向引物Copy之后粘贴也会自动变为5’到3’的序列。所以非常方便。

这样我们PDCD1用于PCR的正反向引物就初步设计好了。如果你只是想P出PDCD1这个基因，现在的引物就可以送去合成了，如果你想将其构建到载体上，那么我们还要对其进行进一步的加工。

Primer 5的使用

根据不同的目的，可以选择不同的载体，如过表达（pcDNA 3.0）、敲减（pLKO.1-TRC）、原核纯化（pGEX-4T1、pET-28a）、病毒包装（pMSCV-puro）、敲除（lentiCRISPR v2）等。下面我们就以过表达载体pcDNA 3.0为例进行讲解。

从质粒图谱上可以看到多克隆位点有多个酶切位点可以选择，那是不是每个位点都可以用呢？不是！我们要 选择那些PDCD1（或其他目的基因）本身没有的酶切位点！

所以我们还需要用Primer 5来分析一下哪些是PDCD1所没有的。

还是打开Primer 5，然后粘贴CDS序列，点击Enzyme，2为所有的酶，我们比对质粒图谱选择多克隆位点的酶，双击即可到3的框中，选好之后点击OK，可以看到PDCD1中有ApaI和KpnI两个酶切位点，所以这两个不可以选，其他的都可以选。

不过一般选择常用好用的最好是实验室就有现成的那些酶了。比如我们选择EcoRI和XhoI，那么我们就可以在对引物加上相应的酶切位点了。

于是我们得到如下引物

好了，我们现在就可以将这些引物送去相应公司合成了。

质粒构建

终于到正题了！

待引物合成之后，我们用ddH2O将其稀释到 100 μM 作为母液，取一些稀释到 10 μM 做下一步实验了。

我们P出目的基因，这一步建议用高保真PCR酶，我常用的是 Toyobo公司的KOD-PLUS-Neo酶 。反应体系及反应条件如下图

模板的获取

PCR完成之后跑1%的胶回收目的片段，也可以直接用PCR Clean试剂盒回收。回收之后将其双酶切，需要酶切适量载体。如果你使用的是Fermentas (Thermo)的酶，还可以打开网址 http://t./RVuwBVo 查询双酶切所用的最佳Buffer。

酶切回收之后的片段进行连接，我使用的是 Thermo公司的T4连接酶 ，体系如下

现在的T4连接酶基本都是快酶，比如Thermo的这款声称10 m就可以连接完成，不过我保险起见，一般连接30 m， 切勿连接过夜！

连接完成之后便是转化，挑菌（单克隆），摇菌抽提质粒，送去测序就OK了！

TRIzol法抽提RNA

提取RNA比较成熟的方法便是TRIzol法抽提，Invitrogen的TRIzol是比较稳定且广泛应用的，现在一些国产的TRIzol类产品也能满足大部分情况下的RNA抽提。

about TRIzol

注意事项及原理

注意事项

1、RNA酶（RNase）非常稳定，是导致RNA降解最主要的物质。它在一些极端的条件可以暂时失活，但限制因素去除后又会迅速复性。用常规的高温高压蒸汽灭菌法和蛋白抑制剂都不能使RNase完全失活。它广泛存在于人的皮肤上，，在与RNA制备有关的分子生物学实验时，必须戴手套。RNase的又一污染源是取液器，一般情况下采用用DEPC配制的70%乙醇擦洗取液器的内部和外部。提取RNA时使用专门的RNase-free的枪头和离心管。

2、TRIzol试剂具有较强毒性，如沾到皮肤立刻用大量的清洁剂和水冲洗！

溶液配方及原理

1、TRIzol试剂TRIzol能在破碎细胞、溶解细胞内含物的保持RNA的完整。其主要成分是苯酚和异硫氰酸胍。苯酚的主要作用是裂解细胞，使细胞中的蛋白、核酸物质解聚得到释放。异硫氰酸胍，是一种强力的蛋白质变性剂，可溶解蛋白质并使蛋白质二级结构消失，导致细胞结构降解，核蛋白迅速与核酸分离。

2、氯仿氯仿可增强TRIzol中的8-羟基喹啉对RNase的抑制作用。氯仿作为有机溶剂，加入氯仿后离心可使溶液分层，上层为水相，下层为有机相。苯酚为弱酸性，酸性条件下（一般为Ph5.0）DNA和蛋白质进入有机相，而RNA留在水相；反之亦然，弱碱性（Ph8.0）时DNA留在水相。

3、异丙醇、无水乙醇、70%乙醇异丙醇和乙醇能与水任意比例互溶，加入异丙醇能够夺取RNA周围的水分，使其脱水沉淀。

4、DEPC水DEPC是RNase的化学修饰剂，它与RNase的活性基团组氨酸的咪唑环反应而抑制其活性。DEPC有毒性，操作时应小心。谁说是最优秀的；谁是最自由的，谁也就是最优秀的，在他们身上，才会有最大的美。

操作步骤

1、细胞破碎

A、组织按1 mL/50~100 mg组织样品的比例向打散的组织块中加入TRIzol试剂，样品的体积不能超过TRIzol体积的10%。

B、贴壁细胞按1 mL/10 cm2的比例直接加入TRIzol试剂，并用移液枪反复吹吸数次。TRIzol试剂过少会导致DNA污染。

C、悬浮细胞悬浮细胞离心收集后，直接按1 mL/5~10×106个细胞（动物、植物或酵母）的比例加入TRIzol试剂。加入TRIzol前不要洗细胞，否则易造成mRNA的降解。

如果样品中含有较多的蛋白、脂肪、多糖或其他细胞外物质，如肌肉、脂肪组织或植物的块根等，可在2℃~8℃，12000×g离心10 m去除这些物质。

关于TRIzol的用量，Invitrogen官方说明书中有建议用量

一般情况下，根据细胞量的多少我的用量是2~3 mL/10 cm Dish、500μL~1 mL/6 cm Dish、200~500 μL/3.5 cm Dish（仅供参考）

2、氯仿抽提分层

加入TRIzol后，室温（15℃~30℃）孵育5 m保证核蛋白复合体充分解离。按0.2 mL/1 ml TRIzol的比例加入氯仿。盖紧管盖后剧烈摇晃15s，室温静置2 3分钟。12000×g，2℃ 8℃离心10 m，转速不可过高否则会导致RNA断裂。离心后液体分为三层，下层为红色的有机相（酚-氯仿），中间为白色的沉淀，上层为无色的水相。RNA在上层水相中，水相的体积约为加入的TRIzol体积的60%。

3、用异丙醇使RNA沉淀

将上层水相转移到一个干净的1.5 mL管中，如需提取DNA或蛋白质就保存下层有机相。

加入与水相等体积的异丙醇，室温孵育10 m。12000×g，2℃~8℃离心10 m。RNA沉淀一般附着在远离离心机轴心的管底，为无色胶状。

4、用乙醇洗涤去除残留的蛋白质和无机盐

去除上清后，用1 mL 75%乙醇（用Rnase-free的水配制）洗涤RNA沉淀。震荡混匀RNA后，7500×g 2℃~8℃离心5 m。

5、用DEPC水溶解RNA

去除上清后，将管子敞口晾5~10 m，使RNA沉淀呈现半透明状。不要让RNA沉淀变成完全不透明，那时RNA完全干燥将会大大影响RNA的溶解。根据后续实验要求加入适量的DEPC水，用移液枪反复吹吸数次后。

逆转录法合成cDNA

一般逆转录（也可称作反转录）都有现成的试剂盒，只要大家按照试剂盒的说明书来操作，问题都不大，在这里我就以TAKARA的逆转录试剂盒为例稍加说明。

Random 6 mers 为随机的6核苷酸引物，引物序列为5'-(P)NNNNNN-3'，特点是产物量大，特异性差，适用于长的或具有Hairp构造的RNA。包括rRNA、mRNA、tRNA等在内的所有RNA的反转录反应都可使用本引物。

Oligo dT Primer 适用于具有Poly（A）Tail的RNA，因而特异性好，但因其只结合Poly A尾巴，对于较长的mRNA，经常不能延伸到5'端。（原核生物的RNA、真核生物的rRNA、tRNA以及某些种类真核生物的mRNA等不具有Poly（A）Tail）。

两种引物可据实际情况使用一种，也可使用。还有一种情况，当只扩增一种目的基因时，也可以使用Specific Primer（PCR时的下游引物）作为反转录引物。

操作步骤

步骤简述如下按照下图中1配制溶液，然后65℃处理后加入3中所配制溶液继续后续反应即可。

连接产物的转化

常用的感受态细胞有DH5α、BL21（DE3）、Rossetta等，而抽提质粒一般用DH5α，可以自己制备也可以购买商业化的感受态。

about Transformation

注意事项

1. 感受态细胞要现用现融，刚刚融化的感受态转化效率最高；

2. 避免反复冻融感受态细胞；

3. 整个操作过程要轻柔，不要用移液器猛烈吹吸；

4. 感受态和连接产物（或质粒）用量要适中，并不是越多越好。

操作步骤

1. 取50 μL感受态细胞置于冰上融化；

2. 加入5 μL连接产物（质粒一般只需用白色枪头沾取一下即可），混匀，置于冰上静置30 m（此时应该打开水浴锅并调温至42℃）；

3. 42℃水浴中热激90 s，迅速置于冰上静置2 m；

4. 加入500 μL无菌的LB培养基（不含抗生素），混匀后置于37℃，200rpm的恒温摇床中培养1 h，使细胞复苏；

5. 连接产物3000 rpm离心5 m，弃上清，留取少量LB（50 μL左右），重悬沉淀，全部均匀涂布于LB培养板（需含相应抗生素）上，37℃ 倒置培养 16 18h；质粒直接取20 50 μL涂于LB培养板上培养即可。

质粒的小量提取

about 质粒抽提

实验原理

较常用的质粒提取方法有三种碱裂解法、煮沸法和去污剂（如Triton和SDS）裂解法。前两种方法比较剧烈，适用于较小的质粒（<15kb）。去污剂裂解法则比较温和，一般用于分离大质粒（>15kb）。

碱裂解法是一种应用最为广泛的制备质粒的方法，其原理为当细菌暴露于高pH值的强阴离子洗涤剂中，会使细胞壁破裂，染色体DNA和蛋白质变性，将质粒DNA释放到上清中。

由于质粒DNA分子比染色体DNA大得多，且前者为共价闭合环状分子，后者为线状分子。只要碱处理的强度和时间不要太过，当pH值恢复到中性时，质粒DNA双链就会形成。

在裂解过程中，细菌蛋白质、破裂的细胞壁和变性的染色体DNA会互相缠绕成大型复合物，后者被十二烷基硫酸盐（SDS）包盖。

当用钾离子取代钠离子时，这些复合物会从溶液中有效地沉淀下来。离心除去沉淀之后，就可以从上清中回收复性的质粒DNA。

本方法采用Tiangen小提中量试剂盒进行提取，其纯化系统是硅基质吸附材料，其原理为在高盐环境下质粒DNA能够结合到硅基质上，再通过去蛋白液和漂洗液将杂质和其它细菌成分去除，用低盐缓冲液或水将质粒DNA从硅基质上洗脱下来。得到的质粒可以用于酶切、PCR、测序、细菌转化、转染等分子生物学实验。

实验试剂（试剂盒试剂配方不清楚，以下配方见《分子克隆实验指南》）

1、溶液P150 mM葡萄糖，25 mM Tris-Cl（pH 8.0），10 mM EDTA，100μg/ml RNase A

原理Tris-Cl用于提供一个合适的缓冲体系；50 mM葡萄糖可以使悬浮后的大肠杆菌不会快速沉积到管子的底部；而EDTA 作为Ca2+和Mg2+等二价金属离子的螯合剂，起到了抑制DNase的作用；RNase作用为去除质粒中混有的RNA，其不受EDTA的影响。

2、溶液P20.2 N NaOH，1% SDS

原理0.2 N NaOH的作用在于使细菌裂解，而SDS作用在于加入P3之后是被其包盖的细菌蛋白，染色体DNA一起作为沉淀析出。

3、溶液P33 M 醋酸钾，2 M 醋酸

原理这一步的K+置换了SDS（十二烷基磺酸钠）中的Na+，得到PDS（十二烷基磺酸钾）沉淀；SDS易与蛋白质结合，平均两个氨基酸上结合一个SDS分子，钾钠离子置换所产生的大量沉淀自然就将绝大部分蛋白质也沉淀了，染色体DNA也被PDS共沉淀。而醋酸用于中和碱，使溶液恢复中性，从而使质粒DNA复性。

操作步骤

1、将过夜培养的菌液（5-15ml）从摇床中取出，并拧紧盖子，9000 rpm离心10 m，用泵尽量吸除上清。若暂时不提取，可将沉淀保存于-20℃，也可直接将菌液保存于4℃（短时间）。

注意如果菌液较多时可以通过几次离心将菌体沉淀收集到一个离心管中。

2、柱平衡步骤向吸附柱中（吸附柱放入收集管中）加入500μl的平衡液BL, 12000 rpm（-13400g）离心1 m，倒掉收集管中的废液，将吸附柱重新放回收集管中（请使用当天处理过的柱子）。

注意若柱子放置较久，需要进行这一步骤；否则，可省。

3、向留有菌体沉淀的离心管中加入500μl溶液P1（请先检查是否已加入RNaseA，并置于冰上 ) ，使用移液器或涡旋振荡器彻底悬浮细菌细胞沉淀，并移至2ml离心管中。如果沉淀的菌体较多，则相应增加P1的用量（之后P2和P3的用量也应成比例增加），并分到几个管子中分别进行步骤4和5的操作（不然P1+P2+P3的总体积超过2ml离心管容积），步骤6过上清时可过同一个吸附柱。

注意菌体量以能够充分裂解为佳，过多的菌体裂解不充分会降低质粒的提取效率。，务必彻底悬浮细菌沉淀，如果有未彻底混匀的菌块会影响裂解，导致提取量和纯度偏低。

4、向离心管中加入500μl溶液P2 ，温和地上下翻转6-8 次使菌体充分裂解。由于P2裂解不应超过5 m，以免质粒受到破坏。故加入P2前将计时器定时4 m，以免超过时间。时间也不可过短，以免裂解不彻底。每管操作时间尽量一致。

注意温和地混合不要剧烈震荡，以免污染基因组DNA 。此时菌液应变得清亮粘稠，如果未变得清亮，可能由于菌体过多，裂解不彻底，应减少菌体量。

5、向离心管中加入700μl溶液P3（记得冰上预冷），立即温和地上下翻转6-8 次，充分混匀，此时会出现白色絮状沉淀。放置冰上10m，之后12000rpm ( -13400g ）离心10 m，此时在离心管底部形成沉淀。如果上清量较大，需要多次过柱，可将上清转移至新的离心管中，以免沉淀飘起。

注意P3 加入后应立即混合，避免产生局部沉淀。如果上清中还有微小白色沉淀，可离心后取上清。

6、将上一步收集的上清液分次加入吸附柱中（吸附柱放入收集管中，其容量为750-800μl）,注意尽量不要吸出沉淀。 12000rpm（-13400g ）离心1m，倒掉收集管中的废液，将吸附柱放入收集管中。

7、可选步骤向吸附柱中加入500ul去蛋白液PD，12000rpm（-13400g ）离心1m，倒掉收集管中的废液，将吸附柱重新放回收集管中。

注意如果宿主菌是end A+宿主菌（TG1，BL21，HB101，JM101，ET12567等），这些宿主菌含有大量的核酸酶，易降解质粒DNA，推荐采用此步。

如果宿主菌是endA-宿主菌（DH5α，TOP10等），这步省略。

8、向吸附柱中加入600μl漂洗液PW（请先检查是否已加入无水乙醇），12000rpm（-13400g）离心1 m，倒掉收集管中的废液，将吸附柱放入收集管中。

注意加入漂洗液PW后，如果室温静置2-5 m，有助于更好地去除杂质。

9、重复操作步骤8。

10、将吸附柱重新放回收集管中置于12000rpm（-13400g ）离心2 m，目的是将吸附柱中残余的漂洗液去除。

注意漂洗液中乙醇的残留会影响后续的酶反应（酶切、PCR 等）实验。为确保下游实验不受残留乙醇的影响，建议将吸附柱开盖，置于室温放置数m，以彻底晾干吸附材料中残余的漂洗液。

11、将吸附柱置于一个干净的离心管中，向吸附膜的中间部位悬空滴加100-300μl洗脱缓冲液EB（65℃预热），室温放置或65℃水浴2 m，12000rpm（-13400g ）离心2m将质粒溶液收集到离心管中。

注意为了增加质粒的回收效率，可将得到的溶液重新加入离心吸附柱中．重复步骤

11、洗脱液的pH 值对于洗脱效率有很大影响。若用水做洗脱液，应保证其pH 值在7.0-8.5 范围内（可以用NaOH 将水的pH 值调到此范围）, pH 值低于7.0 会降低洗脱效率。洗脱缓冲液体积不应少于100μl，体积过小影响回收效率，但也不应过大，以免所提质粒浓度过低，影响后面的使用。且DNA产物应保存在-20 ℃ ，以防DNA 降解。

结果判断

1、使用紫外分光光度计对质粒浓度及纯度进行测定

（1）检测波长为260nm和280nm，浓度看OD260，OD260值为1相当于大约50μg/ml；纯度看OD260/OD280，OD260/OD280比值应为1.7-1.9，偏低可能是蛋白质污染，偏高则可能是DNA降解或RNA污染，如果洗脱时不使用洗脱缓冲液，而使用去离子水，比值会偏低，但并不表示纯度低，因为pH值和离子存在会影响光吸收值。，测出来的OD260和OD280都应该在0.1-2.0之间，不然所得出的浓度和纯度不准确。

（2）应该注意的是作为空白对照的blank管稀释方法应该和所测样品管一样（如样品为2μl所提质粒+48μl ddH2O，则blank为2μl洗脱液+48μl ddH2O）。

2、酶切鉴定，并用琼脂糖凝胶电泳检测

（1）选用合适的内切酶对所提质粒进行酶切，并与未切质粒及转化用原质粒一起用琼脂糖凝胶电泳检测，根据酶切结果及所提质粒与原质粒位置是否一致，可以判定所提质粒是否为目的质粒。

（2）所提质粒（未酶切）的电泳条带可能为一条带，也可能为二到三条带，这是因为质粒提取过程中操作过于剧烈可能使环状超螺旋结构的质粒DNA单链出现缺口（保持环状，失去超螺旋），或双链断裂（变成线状），三种构型的质粒分子在琼脂糖凝胶电泳中的迁移速率是不一样的，会出现多条带，这也说明所得质粒不够理想。

测序结果的分析

构建好质粒之后我们一般先酶切鉴定，鉴定正确的可以直接拿去转染然后做WB检测表达即可。

可以正常表达的质粒我们需要送到测序公司测序，也可以直接送菌液测序，有些测序公司还提供质粒返还服务（即送菌液返还他们抽提的质粒）。

测序的引物一般使用通用引物，如果没有通用引物需要自行设计。常用的通用引物如下

在公众号内回复“ 通用测序引物 ”获取此Excel！

测序结果返回之后我们就可以分析测序结果了。

一般常用的序列比对软件有DNAMAN和Chromas，，还有很多类似软件，大家可以根据个人习惯选择，在这里就不一一介绍了。

DNAMAN

1. 打开软件，左侧数字为各个通道的编号，每个通道只能载入一个序列

2. 然后点击File->New，将我们目的基因的CDS序列粘贴进去，Ctrl+A全选，右键选择Load Selected Sequence，将序列载入通道1。

3. 选择通道2（点击数字2即可），点击File->Open打开测序回来的序列信息（后缀为.seq），同样全选右键载入通道2，之后点击Sequence->Multiple Sequence Alignment；

4. 在弹出窗口中，点击Channel，选中需要比对序列的通道，点击OK即可

5. 后面基本是一直点击下一步，在如下图窗口中选中Try both strands

6. 然后一直下一步，出来如下结果，即可比对测序结果和原CDS序列，如果有突变我们需要看一下是否是同义突变，如果是即质粒序列正确。

Chromas

1. 用Chromas软件打开测序返还的序列信息，然后点击File->Blast Search:

实验复盘四----重组质粒DNA小提

质粒小提试剂盒（TIANprep Mi Plasmid Kit 离心柱型）--碱裂解法

本试剂盒采用碱裂解法裂解细胞，再通过离心吸附柱在高盐状态下特异地结合溶液中的DNA。

碱裂解法抽提质粒主要的试剂为溶液P1,P2,P3，其在抽提质粒DNA中的作用如下

Prepare:

检查试剂盒里的试剂是不是都在，2mL灭菌离心管，涡旋振荡器，12000rpm离心机，ddH 2 O 65℃水浴锅预热，溶液P1保存在4℃冰箱中。

Reference:

1.分子生物学实验教程

2.天根质粒小提试剂盒说明书

请问实验室常用仪器设备有哪些

清洗/消毒设备

超声波清洗器

|

本生灯

|

洗瓶机、清洗机

|

等离子清洗器

|

高压灭菌器高压灭菌锅

|

手消毒器

|

手套箱

|

紫外臭氧清洗仪

制样/消解设备

切片机

|

熔样机

|

抛光机、磨抛机、磨样机

|

切割机

|

离子减薄仪

|

微波消解

|

压片机

|

镶嵌机、镶样机

|

电热消解仪、消化炉

|

电热板

|

等离子体表面处理仪

|

离子溅射仪

|

组织处理仪

|

电子束刻蚀系统

|

缺口制样机

|

红外加热消解系统

|

其它消解设备

分离/萃取设备

微波萃取设备

|

超临界萃取设备

|

抽提萃取、索氏提取、脂肪测定仪

|

离心机、实验室离心机

|

固相萃取装置、固相萃取仪

|

快速溶剂萃取设备/快速溶剂萃取仪

|

超声波萃取仪

|

其它萃取设备

|

在线糖度仪

纯化设备

纯水器、超纯水器、纯水机、超纯水机

|

旋转蒸发仪

|

蒸馏器

|

凝胶净化系统（GPC）

|

浓缩仪

|

氮吹仪

|

分子蒸馏仪

|

大气采样系统(预浓缩仪)

|

其它纯化设备

混合/分散设备

磁力搅拌器、搅拌器、电动搅拌器

|

分散机

|

均质器

、均质机、乳化机

|

匀浆机

|

涡旋振荡器、

化妆品里面的双氧水过氧化氢要怎么检测噢

适用范围

本方法规定了采用高效液相色谱法测定化妆品中过氧化氢（CAS7722-84-1）含量的方法。

本方法适用于染发剂、膏状面膜中过氧化氢含量的测定。

方法提要

试样采用水浸提，部分上清液与三苯基膦衍生反应，衍生溶液经滤膜过滤，用液相色谱分离，紫外检测器检测，峰面积定量，以标准曲线法计算含量，得到样品中过氧化氢的含量。本方法对过氧化氢的检出限为0.0012μg，定量下限为0.004μg。若取0.2g样品，过氧化氢的最低检出浓度为60μg/g，最低定量浓度为200μg/g。

试剂和溶液

除非另有说明，所用试剂均为分析纯，水为一级实验用水。

3.1乙腈，色谱纯。

3.2三苯基膦溶液，称取三苯基膦1.3g，用乙腈（3.1）溶解，定容至25mL，浓度为0.2mol/L，现用现配。

3.3氧化三苯基膦溶液，称取氧化三苯基膦0.0003g，用乙腈（3.1）溶解，定容至100mL，浓度为0.00001mol/L。

3.4过氧化氢，浓度为3%，使用前需要进行标定，标定方法见附录。

3.5过氧化氢标准储备液称取标定过的过氧化氢对照品（3.4）1.5g，精确到0.0001g，置于25mL棕色容量瓶中，用水定容，摇匀，配制成质量浓度为1.8mg/mL的标准储备溶液。

3.6过氧化氢标准工作液配制浓度分别为3.6mg/L、9.0mg/L、18mg/L、36mg/L、54mg/L、90mg/L、180mg/L的标准工作液。

仪器和设备

4.1高效液相色谱仪具有二极管阵列检测器。

4.2涡旋振荡器。

4.3分析天平感量0.0001g。

4.4分析天平感量0.001g。

分析步骤

5.1样液的制备

5.1.1样品前处理

称取样品约0.05g～0.2g（精确至0.001g），含过氧化氢3%以下称取0.2g，含过氧化氢3%～6%称取0.1g，含过氧化氢6%～12%称取0.05g，置于100mL容量瓶中，加入约50mL水，振摇至样品完全溶解，用水定容，摇匀备用。面膜等半固体样品可以称取样品于50mL烧杯，加入约20mL，用玻璃棒将样品搅碎，用水转移至100mL容量瓶中，定容，摇匀备用。

5.1.2衍生化反应

分别移取过氧化氢标准工作液（3.6）和样液（5.1.1）各1mL于10mL棕色容量瓶中，加入1mL三苯基膦乙腈溶液（3.2），振摇，继续加入5mL乙腈（3.1），振摇，用水定容，摇匀。置于暗处室温反应30m。

5.2测定

5.2.1色谱参考条件

色谱柱C18色谱柱，4.6mm×250mm，5mm；

流动相乙腈+水（60+40）（体积比）；

流速1.0mL/m；

检测波长225nm；

进样量10uL。

5.2.2标准曲线的绘制

吸取10uL氧化三苯基膦溶液（3.3），注入高效液相色谱仪，确定氧化三苯基膦的保留时间。衍生化反应结束后，立即开始色谱分析，分别吸取10mL过氧化氢标准工作液衍生液（5.1.2）注入高效液相色谱仪，2h内完成上机分析。在上述色谱条件下测定其峰面积，记录氧化三苯基膦的峰面积，以标准溶液浓度为横坐标、氧化三苯基膦的峰面积为纵坐标，绘制标准工作曲线。

5.2.3样品中过氧化氢的测定

衍生化反应结束后，立即开始色谱分析，吸取10mL样液（5.1.2）注入高效液相色谱仪，2h内完成上机分析。在上述色谱条件下测定其峰面积。利用回归方程式计算样液中过氧化氢的浓度。

5.3平行实验

按以上步骤操作，对同一样品独立进行测定获得的两次独立测试结果的绝对差值不得超过算术平均值的10%。

结果计算

式中w——化妆品中过氧化氢的含量，%；

r——由回归方程式计算待测样液（5.1.3）中过氧化氢的质量浓度，mg/L；

V——样品定容体积，mL；

D——样品稀释倍数；

m——样品取样量，g。

回收率与精密度

方法的回收率为99.9%～107.3%，相对标准偏差小于7%（n=6）。

西吡氯铵的检测方法

1 适用范围

本方法规定了采用液相色谱法测定化妆品中西他氯铵（122-18-9）的方法。

本方法适用于膏霜类、乳液类和水类化妆品中西他氯铵的测定。

2 方法提要

样品在经过提取后，经高效液相色谱仪分离，二极管阵列检测器检测，峰面积定量，以标准曲线法计算含量。本方法对苄索氯铵、劳拉氯铵和西他氯铵的检出限、定量下限、检出浓度和最低定量浓度如表1所示。

表1 西他氯铵 检出限 0.03mg 定量下限 0.1mg 检出浓度（0.5g样品） 9mg /g 最低定量浓度（0.5g样品） 30mg /g 3 试剂和材料

除另有规定外，所用试剂均为分析纯，水为一级实验用水。

3.1 西他氯铵，纯度≥99%。

3.2 甲醇，色谱纯。

3.3 醋酸铵，色谱纯。

3.4 冰醋酸，优级纯。

3.5 标准储备液取西他氯铵各0.05g，精确至0.0001g，置50 mL棕色容量瓶中，用甲醇（3.2）溶解并定容，摇匀，配成质量浓度为1g/L的标准储备溶液。

3.6 标准工作溶液配制浓度分别为5mg/mL、20mg/mL、30mg/mL、50mg/mL、80mg/mL和100 mg/mL的西他氯铵的混合标准工作溶液。

4 仪器

4.1 高效液相色谱仪具有二极管阵列检测器。

4.2 分析天平感量0.0001g。

4.3 分析天平感量0.001g。

4.4 精密pH计精度0.01。

4.5 涡旋振荡器。

4.6 超声波清洗器。

5 测定步骤

5.1 样品前处理

称取样品0.5g，精确至0.001g，置于25mL具塞刻度管中，加入20 mL甲醇（3.2），涡旋振荡1 m，超声（功率400W）提取15m，取出，冷却至室温后用甲醇（3.2）定容至25mL，混匀，经0.45 mm滤膜过滤，滤液作为待测样液，备用。

5.2 测定

5.2.1 色谱条件

色谱柱CN 柱，250 mm×4.6mm，5 mm；

流动相甲醇+0.1mol/L醋酸铵缓冲溶液（冰醋酸调pH至5.0）（75+25）；

流速1.0 mL/m；

检测波长260nm；

柱温25℃；

进样量20mL。

5.2.2 测定方法

取标准工作溶液分别进样，以目标峰面积为纵坐标，标准溶液浓度为横坐标进行线性回归，建立三条标准工作曲线。取“5.1”项下处理得到的待测溶液进样，根据测定成分的峰面积，分别代入三条标准工作曲线上，得出西他氯铵的质量浓度。按“6计算”，计算样品中西他氯铵的含量。

5.3 平行实验

按以上步骤操作，对同一样品独立进行测定获得的两次独立测试结果的绝对差值不得超过算术平均值的10%。

6 计算

式中

w ——化妆品中西他氯铵的质量分数，%；

m —— 样品取样量，g；

ρ—— 从标准工作曲线上查得的待测样液中西他氯铵的质量浓度，mg/mL；

V—— 样品定容体积，mL；

D —— 稀释倍数。

7 回收率与精密度

方法的回收率为87%～107.3%，相对标准偏差小于6%（n=6）。

实验室仪器设备的配置原则？

、植物总DNA提取设备配置

植物总DNA提取的必备的设备有研钵、液氮罐、电热恒温水浴锅、小容量离心机、大容量离心机、冰箱、紫外分光光度计等。

二、PCR反应系统设备配置

一个实验室要能进行PCR反应实验，一般要具备以下实验设备超净操作台、涡旋振荡器、小容量离心机和PCR仪。由于PCR技术的提高，其对环境的要求也有所降低，所以为了方便，许多人做PCR反应已不在无菌操台上进行了。尽管如此，超净操作台还是分子实验室必备的仪器，有不少实验是必须在超净操作台上进行的。

三、 凝胶电泳及显色系统设备配置

凝胶电泳系统的主要功能是检测提取的总DNA质量及PCR扩增产物。整个过程的完成需电泳仪、电泳槽、微波炉、摇床、胶盆、灯箱、紫外灯和一些常规的小件工具。

四、 凝胶成像及数据处理系统设备配置

为了能观察、记录实验过程、永久地保存实验结果以及对大量分子数据进行处理分析，凝胶成像、图像保存及数据处理系统是必不可少的。对于分子植物育种实验来说，分子数据的获得及分析是分子育种中非常核心的一步。只有对所得分子数据结合表型数据进行充分详实的分析，才能在实际育种中得到更有效的运用。这一系统主要包括凝胶成像系统、扫描仪、及各类生物应用软件。

五、其它的常规设备

分子生物学实验对实验操作环境及反应溶液的条件要求很高。，是实验用水的水质要好、纯度要高。大部分实验用水都要求是超纯水。必需配置纯水器和超纯水器。，是无菌环境。离心管、Tip头、一些配溶液的器皿以及不少溶液都必需灭菌消毒。因而高压灭菌锅和烘干箱也是分子实验室必不可少的。很多的实验过程要始终在无菌条件下进行，所以无菌操作台是不可或缺的。，是溶液的取样、pH值要精确，溶液纯度要高。故高精度的电子天平和pH 计是配药时必备的仪器，而磁力加热搅拌器则是配的一个好帮手。还有移液器，它是一种精确取样的仪器，根据取样量的需要，可选择不同取样大小的移液器分子。这就需要有良好的冷藏系统，一般分子实验室要具备4℃、-20℃的冰箱，条件较好的最好有-70℃ 的超低温冰箱。

六、易耗品

作为一个分子实验室，易耗品是相当多的，在这里主要提到一些用量比较大的 用品。，是手套。在实验室里，每当接触时，不管是否有毒，

实验室仪器http://.hnsyyq./

原则上都得戴上手套，所以手套的用量是相当大的。，是Tip头和Tip头盒。Tip头与移液器配套用于移取溶液、加样等。还有离心管及离心管架，这些离心管必须与实验室的离心机和PCR仪相匹配，而离心管架也得与离心管配套。是玻璃板、梳子、胶条和夹子，这也要根据实验室的电泳槽而定，通常买电泳槽时会有配备一些，不过这些量一般是不够的，还得自己另行购买。

本公司专业生产及维修盐雾试验箱，紫外老化试验箱,高低温试验箱,振动试验台

,恒温恒湿试验箱,氙灯老化试验箱,臭氧老化试验箱,真空干燥箱，烘箱

什么是涡旋混合器

漩涡混合器漩涡混合器是一种将振荡和涡旋巧妙结合的实验室仪器，能够适用于多种混匀和漩涡振荡操作，使实验更加方便，快捷。 发展过程 1.国内一般的振荡器和涡旋器是分开的，一台机器往往只能处理一项操作，大大限制了实验的过程，目前国外出现的混匀小精灵可以解决这种矛盾，它将振荡和涡旋巧妙的结合到一台机器上。它不但能混匀各种微量管、PCR板、深孔板和微孔板等实验室常用耗材，还具备 Vortex 振荡混匀各种试管的功能，大大方便了实验过程。但由于价格相对较高而没有被广泛使用。 2 维混匀操控最新研究结果发现，转速 (rpm) 并非是有效混匀微量体积样品的唯一决定因素。更多的时候，完美的混匀往往发生在转速、混匀运转模式（例如，旋转）以及旋转半径等众多影响因素均被优化条件下。 混匀小精灵已完美地综合了各项影响因素，即 2 维混匀操控。 漩涡混合器的工作内容 ● 工作板 ● 96孔PCR板（带裙边，半高裙边，无裙边) ● 384孔PCR板 ● 96孔和384孔深孔板 ● MTP微孔板，酶标板 ● 微量离心管 ● 0.2ml PCR管，PCR排管 ● 0.5ml微量管 ● 1.5ml微量管 ● 2.0ml微量管 ● Vortex振荡混匀各种类型的试管 产品应用 快速可控混匀使孔与孔/ 管与管之间实验条件均一化，可以提高重复性。 ● PCR 反应体系制备 ● 沉淀重悬(如 细菌、DNA、细胞培养沉淀) ● 孵育(ELISA 酶免分析) ● 蛋白染色定量（如Bradford、Lowry、BCA） ● 报告基因分析（如β- 半乳糖苷酶、荧光素酶分析） ● 酶反应体系预混 ● 振荡混匀各种试管 Mix Smart混匀小精灵标准配置包括三种试管支架 ● 96孔PCR板/管支架，适合0.2mlPCR管、PCR排管、96孔PCR板（半高裙边、无裙边） ● 0.5ml试管支架 ● 1.5/2.0ml试管支架 ● 96孔带裙边PCR板、384孔PCR板、微孔板、深孔板，可直接放入MixMate 混匀， 无需支架 技术参数 ● 电源100～230，50-60Hz，功率45W ● 尺寸172414cm ● 重量4.5kg ● 噪音<52 分贝 ● 混匀频率300-3,000 rpm (以10rpm递增） ● Vortex 振荡混匀频率3,500 rpm ● 混匀时间: 15秒到99小时59分钟，可连续运转 混匀小精灵

● 振荡和混匀半径1.5mm（3mm振幅）

质粒如何提取

需要掌握技能

1.

质粒转化

具体操作步骤



将1ul

质粒DNA加入1.5ml的离心管；



将感受态细菌（petent

cells）从－70℃冰柜中取出，快速吸取50ul感受态细菌，加入含质粒DNA的1.5ml的离心管；



轻轻地旋转以混匀内容物，在冰中放置30～60

m；



42度热休克90s（该时间应该非常准确，用Timer记时），冰上放置5m；



每管加500ul

LB培养液，放37℃水浴1h；



吸取200ul培养物至含相应抗生素的90mm

LB平板上，涂布棒将培养液涂布均匀；



倒置平皿，于37℃培养，12～16h后可出现菌落。

2.

质粒的抽提

具体操作步骤



用前将RNase

A管的液体全部加到

SolutionⅠ（加好RNaseA的溶液I一般储存在4℃）；



将60ml的乙醇加到洗涤缓冲液瓶



37℃培养16h的平板中挑取一个单菌落（直径2～3mm），接种到10ml

LB培养液

37℃剧烈振摇培养16

h；



取4ml菌液到5ml

离心管，8000rpm室温离心3m；



去上清，放于面巾纸上吸干痕液，



加250

ul

Solution

Ⅰ（注意用前应该加RNase

A管），于涡旋振荡器重悬细胞；



加250

ul

37℃预热2-3m的Solution

Ⅱ；



加350

ul

Solution

Ⅲ，将5ml离心管置于拇指和食指间柔和地反复颠倒数次；



将5ml离心管中的溶液倒入1.5ml

离心管中，



室温孵育2-3m，12000rpm

4℃离心15

m；



装配2ml

收集管（白色）和柱状收集管（蓝色）



将上清倒入柱状收集管（蓝色）中；



8000rpm室温离心3m；



去掉收集管中的液体，加500ul

Buffer

HB

到柱状收集管中，10000rpm室温离心1m；



去掉柱状收集管中的液体，加750ul

Wash

Buffer（注意用前加乙醇），10000rpm室温离心1m；



重复上述步骤一次；



不加Wash

Buffer将管子10000rpm室温离心1m；



将柱状管放到一个消过毒的1.5ml

离心管中，加65ul灭菌水，室温放置2m，8000rpm室温离心3m

洗提（洗脱）DNA。

3.

质粒电泳

具体操作步骤（以倒20ml的胶为例）



用50ml量筒量取20ml

1XTAE；



用电子天平称量0.16g琼脂糖，并倒入20ml电泳缓冲液中；



将称量纸覆盖在装有琼脂糖的电泳缓冲液的三角瓶中，放入微波炉中转1m30s，至肉眼看不到颗粒状琼脂为止；



至室温待溶液冷却至60度左右，将三角瓶中溶液倒入制胶盒中，并加入上样梳子；



至室温约30m胶凝固后，拔掉梳子并将凝胶安放到电泳槽内；



向电泳槽加入电泳缓冲液，刚好没过凝胶约1mm；



将样品中加入适量的10X上样缓冲液，该上样缓冲液的体积计算如下如果样品体积是20ul加入2ul

10X上样缓冲液，如果是30ul，加入3ul

10X上样缓冲液；



将样品加入上样槽中，打开电源，一般为120v，电泳约20-30m，关掉电源，在Dark

Reader荧光透射仪观察结果。

胶稠度是什么？是胶蛋白吗？急！在线等

两个不是同一个概念，胶稠度是一个衡量稠度的量，而胶蛋白是一种物质。下面是中国的标准米质测定方法 中华人民共和国农业部部标准米质测定方法 中华人民共和国农业部部标准米质测定方法NY 147－88

1 适用范围本标准适用于食用稻米品质的测定。2 引用标准GB 2905 谷类、豆类作物种子粗蛋白质测定法 （半微量凯氏法）GB 3523 谷类、油料作物种子水分测定法GB 4801 谷类籽粒赖氨酸测定法 染料结合赖氨酸（DBL）法GB 5495 粮食、油料检验 稻谷出糙率检验法GB 7648 水稻、玉米、谷子籽粒直链淀粉测定法NY 122 优质食用稻米3 样品的准备3.1 稻谷在收获晒干后须存放三个月以上，待理化性状稳定后，方可进行分析。3.2 加工的稻谷须扬净稻草、瘪粒，并除去砂石、泥块、铁屑等混杂物。稻谷品种纯度不得低于99.0%。3.3 待测样品须放于干燥通风处或有空调的实验室内1周左右，使样品的水分含量为13%±1%，含水量的测定根据GB 3523。4 碾磨品质的测定4.1 出糙率的测定4.1.1 常样法4.1.1.1 仪器设备 实验室用谷物脱壳机4.1.1.2 测定方法 a. 根据待测样品谷粒的厚度，调节脱壳机滚轮（或辊子）的间距（一般在0.50～1.00mm之间），使样品经二次处理后，基本上脱壳完全。b. 机器空转数圈，以清除机内残留的稻谷和米粒。 c. 称取130.0g稻谷，倒入进样漏斗中，打开电源开关，调节进样闸口，使样品均匀进入机内脱壳。 d. 经二次脱壳后，检出样品中残留的谷粒并称其糙米和谷粒的重量，精确到0.1g。4.1.1.3 结果的表述出糙率按公式（１）计算出糙率（%）＝ ……………………（１）重复测定一次，求出二次出糙率的平均值。前后二次测定结果的相对相差不应大于1%。4.1.2 小样法按GB 5495方法测定。4.2 精米率的测定4.2.1 仪器设备JMJ－100型精米机或其他同类型号的实验室精米机。4.2.2 测定方法4.2.2.1 称取100g糙米，精确到0.1g，放入精米机的碾米室内。4.2.2.2 调节碾米室盖的压力至3kg左右，再调节定时器的碾米时间，使碾米精度达国家标准一等米的水平。4.2.2.3 碾磨后的米样经手工除去糠块，再用1.5mm直径的筛子除去胚片和糠屑。4.2.2.4 待米样冷却至室温后，称精米重，精确到0.1g。4.2.3 结果的表述精米率按公式（２）计算精米率（%）＝ ……………………………（２） 重复测定一次，求出精米率平均值。二次测定结果的相对相差应小于1.0%。4.3 整精米率的测定4.3.1 仪器设备整米分离机或具不同圆孔直径的筛子一套。4.3.2 测定方法4.3.2.1 精米样品的制备精米样品制备的方法基本上同4.2.2，但掌握碾米的精度为糙米去糠率的10%±0.5%。4.3.2.2 整精米样品的分离借助于整米分离机或筛子，自以上精米样品中人工分离出整精米（整精米系指肉眼观察无破损的完整精米粒），称重，精确至0.1g。4.3.3 结果的表述整精米率按公式（３）计算整精米率（%）＝ ………………………………（３）重复测定一次，求出整精米率平均值。两次测定结果相对相差应不超过2.0%。5 外观品质的测定5.1 长宽比的测定5.1.1 仪器设备谷物轮廓仪、照相放大机或微粒子计。5.1.2 测定方法从整精米样品中随机取出整精米10粒，在谷物轮廊仪上读出米粒的长度和宽度，以毫米为单位，读数精确至0.1mm。精米的长度系指整精米两端间的最大距离；宽度系指米粒最宽处的距离。5.1.3 结果的表述求出长度和宽度的平均值，按公式（４）计算其长宽比长宽比＝ ………………………………………（４）重复测定一次，求得二次长宽比的平均值。二次相对相差应不大于0.1。5.2 垩白度的测定5.2.1 仪器设备聚光灯、黑色背景的玻璃板。5.2.2 测定方法5.2.2.1 垩白米率从整精米样品中随机取出整精米100粒，置于玻璃板上，在聚炮灯下观察，拣出有垩白（包括心白、腹白、背白）的米粒，按公式（５）求出垩白米的百分率。重复一次，取二次测定的平均值，即为垩白米率 垩白米率（%）＝ ……………………………………（５）5.2.2.2 垩白大小随机取垩白米10粒，在聚光灯下平放，逐粒目测垩白面积占整个籽粒面积的百分数，求出垩白面积的平均值。重复一次，二次测定结果的平均值即为垩白大小。5.2.3 结果的表述垩白度指整精米样品中垩白的面积占样品总面积的百分比。垩白度按公式（６）计算垩白度＝垩白米率×垩白大小 ………………………………………………（６）垩白度可分为五个等级，见表１。表1 垩白度分级级 别垩白度范围12345＜11～56～1010～20＞20 5.3 透明度的测定5.3.1 仪器设备DWY－A型数字式稻米透明度测定仪。5.3.2 测定方法和结果的表述5.3.2.1 接通电源，按下测定钮，调节仪器的内参标准透明度为1.00。5.3.2.2 把整精米样品尽可能均匀地装入样品杯内，在透明度仪上测出其透明度。重复测定一次，二次测定相对相差不应大于0.02。5.3.2.3 稻米的透明度分五级，见表2。表2 透明度分级级 别透明度范围12345＞0.700.61～0.700.46～0.600.31～0.45＜0.31 6 蒸煮和食味品质的测定6.1 胶稠度的测定6.1.1 仪器设备6.1.1.1 长100mm，内径11.0mm的标准试管6.1.1.2 沸水浴6.1.1.3 涡旋振荡器6.1.1.4 冰水浴6.1.1.5 直径1.5cm的玻璃球6.1.1.6 带毫米格纸的水平台6.1.2 试剂6.1.2.1 0.200 mol/L氢氧化钾溶液用氢氧化钾（GB 2306－80；分析纯）配制并标定。6.1.2.2 0.025%百里酚蓝指示剂称取25.0mg百里香酚蓝（HG 3－1223－79；分析纯），用95%乙醇（GB 679－80；分析纯）溶解并稀释到100mL。6.1.3 测定方法和结果的表述6.1.3.1 用4.3.2.1精米样品制备过0.15mm孔径的筛，含水量为12%的精米粉样2～3g。称粉样0.1000g，置于试管内，加入0.20mL百里酚蓝指示剂，用振荡器加以振荡，使样品充分湿润分散。准确加入0.200mol/L氢氧化钾溶液2.0mL，用振荡器振荡。混匀后立即放入剧烈腾的水浴内，用玻璃球盖住试管口，调节水面高度，使沸腾的米胶高度始终维持在试管长度的三分之二左右，糊化时间为8m。糊化完毕后，取出试管，取去玻璃球，在室温下冷却5m。将试管在冰水浴中冷却20m。在室温25±2℃下，将试管平放在水平台上。1h后，量出试管底至冷胶前沿的长度，以毫米表示，即为样品的胶稠度。6.1.3.2 在测定每批样品胶稠度的，用已知胶稠度的标准米粉样品一套（应包括硬、中、软胶稠度）作为内标样一起进行测定。内标样实测的胶稠度与标准数值的相对相差应在下列范围以内软、中5mm；硬3mm。重复测定一次，二次测定结果相对相差不应大于软、中5mm；硬3mm。6.1.3.3 胶稠度可分为三类，见表3。表3 胶稠度分类类 别米胶长度mm硬胶稠度中胶稠度软胶稠度≤4041～60≥61 6.2 糊化温度的测定（碱消法）6.2.1 仪器设备6.2.1.1 5cm×5cm×2cm的有机玻璃或塑料制的有盖方盒6.2.1.2 恒温箱6.2.1.3 10mL移液管6.2.2 试剂 1.70%(m/V)的氢氧化钾溶液；用氢氧化钾（GB 2306－80；分析纯）配制并标定。6.2.3 测定方法和结果的表述6.2.3.1 取6粒成熟饱满的整精米置于方盒内，加入10.0mL 1.70%氢氧化钾溶液。用玻璃将盒内米粒排布均匀，加盖。将方盒平稳移至30±2℃的恒温箱内（移动方盒时应防止米粒移动），保温约23h，再平稳地取出。逐粒观察米粒胚乳的分解情况，按表4进行分级记录（以分解度为主）。 表4 碱消值分级级别分解度消晰度1米粒无变化米心白色2米粒膨胀米心白色，有粉末状环3米粒膨胀，环不完全或狭窄米心白色，环棉絮状或云雾状4米粒膨大，环完整而宽米心棉白色，环雾状5米粒开裂，环完整而宽米心棉白色，环云清晰6米粒部分分散溶解，与环融合在一起米心云白色，环消失7米粒完全分散米心与环均消失6.2.3.2 稻米样品的碱消值用公式（７）计算 碱消值＝ ………………………………………………（６）式中Ｇ――每粒米的级别；Ｎ――同一级的米粒数。6.2.3.3 在测定每批样品糊化温度的，用已知糊化温度的标准样品一套（包括高、中、低三种糊化温度）作为内标样一起进行测定。内标样实测的数值与已知标准数值相对相差应在0.5级以内。6.2.3.4 稻米的糊化温度可分三类，见表5。表5 糊化温度分类类 别碱消值糊化温度范围（℃）高糊化温度中糊化温度低糊化温度1～3级4～5级6～7级＞7470～74＜70 重复测定一次，二次测定结果的相对相差应小于0.5级。6.3 直链淀粉含量的测定6.3.1 国标法按GB 7648方法测定。6.3.2 改进简化法6.3.2.1 仪器设备a. 可见光分光光度计；b. 分析天平，感量0.0001g；c. 水浴锅；d. 100mL容量瓶；e. 5mL移液管。6.3.2.2 试剂a. 1.00mol/L的氢氧化钠溶液；用氢氧化钠（GB 629－81；分析纯）配制并标定；b. 0.09mol/L氢氧化钠溶液取90mL 1.00mol/L氢氧化钠溶液，用蒸馏水稀释至1000mL；c. 碘液称量2.0000g碘（GB 675－77；分析纯）和20.0000g碘化钾（GB 1272－77；分析纯）混合，用蒸馏水溶解后，定容至1000mL；d. 95%乙醇（GB 679－80；分析纯）；e. 1.00mol/L乙酸溶液量取57.8mL冰乙酸（GB 676－78；分析纯），用蒸馏水稀释至1000mL。6.3.2.3 测定方法 a. 用4.3.2.1的精米样品制备过0.25mm孔径的筛的米粉样品2～3g，置于100mL容量瓶中，加入1.0mL 95%乙醇，轻摇容量瓶，使样品湿润分散，加入9.0mL 1.00mol/L的氢氧化钠溶液，使碱液沿颈壁缓慢流下，旋转容量瓶，使碱液冲洗粘附于瓶壁上的样品。将容量瓶置沸水浴中煮10m后取出，冷却至室温后加蒸馏水定容。吸取5.0mL样品溶液，加入已盛有半瓶蒸馏水的100mL容量瓶中，再在这一容量瓶中加入1.0mL 1.00mol/L的乙酸溶液，使样品酸化，加入1.50mL碘液，充分摇匀。用蒸馏水定容，静置20m。以5mL 的0.09mol/L的氢氧化钠溶液代替样品，配制空白溶液。用空白溶液于分光光度计波长620nm处调节零点并测出有色样品液的吸光度值。 b. 标准曲线的绘制称取与待测样品保存在同样的条件下三天以上的高、中、低已知直链淀粉含量的标准样品（其直链淀粉含量预先经ISO 6647－1987或GB 7648方法准确测定）各0.1000g，用上述改进简化法与待测样品进行测定。以标样的直链淀粉为纵坐标，以相对应的吸光度为横坐标，绘制标准曲线或列出曲线的回归方程式 …………………………………………（８）式中Ｙ――样品的直链淀粉含量；a――标准曲线的截距；b――标准曲线的斜率；x――样品的吸光度值。6.3.2.4 结果的表述稻米样品的直链淀粉的含量以直链淀粉占样品干重的百分比表示，可用样品的吸光度值从直链淀粉标准曲线上直接读出或从标准曲线的回归方程式中求出。重复测定一次，二次测定结果的相对相差应小于1%。6.4 米饭食味的评定参照NY 122的方法。7 营养品质的测定7.1 粗蛋白质含量的测定采用GB 2905的方法。7.2 赖氨酸含量的测定采用GB 4801的方法。

附加说明本标准由中华人民共和国农业部农业局提出。本标准由中国水稻研究所谷化系负责起草。本标准主要起草人罗玉坤、林榕辉、陈玉英、吴戊君、闵捷。 附录 部分标准清理整顿前后标准号对照表原标准号现行标准号GB 4801－84GB 5006－85GB 6193－86GB 7648－87GB 7649－87GB 7650－87NY 147－88NY/T 9－1984NY/T 11－1985NY/T 13－1986NY/T 55－1987NY/T 56－1987NY/T 57－1987NY/T 83－1988